话说在基因工程里，把质粒和目的基因“连”上那是必须要下大功夫的。这第一步的关键，是大家都知道的双酶切，毕竟只用一种限制酶切出的黏性末端很容易自己首尾相连或者反着接，必须得有两个酶同时开工，才能让它们的末端正好对上。不过实际情况总是不完美，要是DNA片段压根就不含目标酶切位点，那就只能想办法引入同尾酶位点或者用试剂盒来补漏洞了。 这种问题还常常会出现在高考题里。比如2016年全国卷Ⅰ那个例子，质粒上有氨苄青霉素抗性（Ampr）和四环素抗性（Tetr）两个“开关”，外源DNA插进去以后，对应的抗性就会消失。实验就是用BamHⅠ把质粒和目的基因切开，再用DNA连接酶把它们缝一块儿，然后直接给大肠杆菌用CaCl₂处理成感受态送去转化。最后出现了四种情况：没被转化的空白、只含环状目的基因、只含质粒载体，还有插入了目的基因的重组质粒。 筛选的时候麻烦就来了，氨苄青霉素平板根本区分不了没转化的空白菌和那个只含环状DNA的情况，它们都不长；同样，空载的质粒和重组的质粒在氨苄培养基上都能疯长，因为抗性基因还在呢。想要一下子把真重组找出来，就得再加上一轮四环素筛选。只要能在含四环素平板上长出来的，那肯定就是插入了目的基因而且破坏了四环素抗性的家伙。 浙江的模拟题也有讲究。比如2018年温州选考里有张质粒图谱标了BamHⅠ、HindⅢ这些酶切位点。解决办法是必须用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，这样才能产生互补末端防止自己连起来或者接反了。目的基因和质粒都按这个方法处理一遍之后，再用T4 DNA连接酶把它们连起来。把连接产物转到大肠杆菌里去扩增重组质粒之后，最后再转到原生质体完成表达。 总结一下高频考点吧：双酶切就是为了精准对接，单酶切风险大得很；抗性基因失活就是黄金标签；四环素抗性丢了就意味着重组成功了；CaCl₂处理加上冰浴能提高转化率；影印法一板多筛既省事又省力。掌握了这些细节，遇到“质粒+目的基因”的连接题就不会手忙脚乱了。